الكرومتوجرافيا عالية الكفاءة

طرق الكروماتوجرافي عالي الكفاءة ( عالي السرعه ) للسوائل : 
High Performance Liquid_Chromatography (HPLC) 

تعتبر هذه الطريقه أهم تطوير في طرق الفصل الكروماتوجرافي للسوائل وفيها يكون الوسط الساكن على هيئة جسيمات دقيقه الحجم ويدفع بالوسط المتحرك ( السائل ) خلال العمود المملوء بالوسط الساكن بإستخدام مضخه عند ضغوط تصل إلى 8000 رطل على البوصه المربعه (Psi )

المكونات الأساسية لأجهزة HPLC :

المكون الأول : خزانات الطور المتحرك وأنظمة معالجة المذيب : تصنع هذه الخزانات من مادة الزجاج أو من الحديد الغير قابل للصدأ Stan less Steel وفي الغالب تتراوح عدد الخزانات 1-5 خزانات ومتوسط السعة للخزانات 500 ml وبعضها يصل سعته إلى لتر . وتكون هذه الخزانات في العادة مزودة ببعض الوسائل التي تساعد على التخلص من الغازات الذائبة في المحاليل تظهر على شكل فقاعات هوائية وهذه تسبب في ظهور إشارات تحليلية غير مرغوب فيها مما قد يسبب خلطاً في النتائج المتحصل عليها . ومن أكثر هذه الغازات : (O2 , N2 )

ويتم التخلص من هذه الغازات بعدة طرق ، منها :

1. باستخدام نظام التفريغ باستخدام مضخات . 2. باستخدام عملية التقطير Distillation . 3. باستخدام أجهزة تسخين وتحريك المذيبات . 4. بإمرار تيار من غاز خامل منخفض الذوبانية . 5. وأحياناً هذه الخزانات تكون مزودة بمرشحات (Filters) ، وذلك للتخلص من أي مواد عالقة أو غبار بالمحاليل ومنعها من الوصول إلى عمود الفصل 6. وإذا كان الفصل يتم باستخدام طور متحرك (مذيب) واحد يطلق على هذا النوع من الفصل في تقنية (HPLC) بفصل الأيزوكرات Lsocrat1ic Elution

المكون الثاني : أنظمة الضخ Pumping Systems هناك مجموعة من المضخات الشائعة الاستخدام والتي يجب أن تتوفر فيها بعض الشروط : 1. أن تكون المضخة قادرة على إعطاء ضغط يصل إلى 6000 ib/in2 على افتراض أن العمود مصنوع من الحديد ، أما في حالة الزجاج فينبغي أن يكون أقل من ذلك . 2. أن تكون المضخة خالية من الذبذبات أثناء دفعها للسوائل Pulse Free . 3. أن تكون المضخة لها سرعة سريان تتراوح بين 0.1-10 ml/min (أي يكون لها مدى واسع ) . 4. أن تكون لسرعة السريان تكرارية عالية ، ونسبة الخطأ لا تزيد عن 0.56% . 5. أن تحتوى على مكونات مقاومة للتآكل ، خاصة ما يسمى بالمسدات Seals ، وأن تكون مصنوعة من الحديد أو من التفلون

ثالثاً : أنظمة التحكم في السريان والبرمجة Flow control & Programming

هذه الأنظمة هي من المكونات الجانبية ، تتواجد في الأجهزة الحديثة مكون خراجي يحتوي على بعض المعدات مثل الحاسب الآلي وظيفتها الأساسية التحكم والسيطرة على ثباتية العوامل الأساسية مثل : ( سرعة السريان ، الضغط ، الزوجة ، خلط الطور المتحرك ) .

المكون الرابع : أنظمة حقن العينة sampling Injection Systems

هذه الأنظمة هي وحدة من جهاز (HPLC) والتي تستخدم لإدخال العينة إلى العمود الكروماتوجرافي ويعتبر هذا النظام العامل المحدد Limiting Factor لدقة القياسات حيث تتحكم في إدخال العينة إلى الجهاز . أكثر طرق (HPLC) تستخدم لنظام الحقن نظام يسمى Sampling loop حلزون العينة وهذه الأنظمة تستخدم في الغالب – عينات حجمها يتراوح ما بين (5-500 ul ) ، وبعضها يستخدم عينات لحجم العينة تتراوح بين (0.5-500 ul ) . وهناك نوعان من الموديلات لآلية عمل صمامات الحقن الحلزوني : 1. وضع تحميل العينة model (A) : loading mode وفي هذا النوع تدخل العينة بدون أن نلتقي مع الطور المتحرك 2. وضع حقن العينة model (B) : Injection mode وهنا نفتح لها المجال بحيث تلتقي مع الطور المتحرك . ومع مراعاة أن تكون الفترة الزمنية بين العمليتين قصيرة جداً .

المكون الخامس : أعمدة الكروماتوجرافي السائل liquid chromatographic columns

يمثل العمود القلب بالنسبة لجهاز التحليل الكروماتواجرافي ، وتصنع مادة العمود عادة من الفولاذ المقاوم للصدأ وتكون جدرانه سميكة . وتصنع أحياناً من الزجاج السميك وفي حالة استخدام عمود زجاجي فإن المضخات المستخدمة لا يتجاوز ضغطها 600 psi معظم الأنابيب تكون قصيرة الطول ، والطول الأكثر شيوعاً 25 cm وهناك نوعان من الأعمدة : 1. النوع الأول : الأعمدة التحليلية Analytical Columns هي الأعمدة الأساسية ، أطوالها تتراوح ما بين 10-30 cm ، تكون في العادة مستقيمة . تتميز الأعمدة التحليلية بقطر داخلي يتراوح ما بين 4-10 mm وحديثاً تمكنت بعض المصانع من صنع أعمدة ذات كفاءة عالية ، فصنعت أعمدة لها أقطار تتراوح ما بين (1-4.6 mm ) وأصبح بالإمكان الحصول على طول ما بين 3-7.5 cm وهذا النوع من الأعمدة يستهلك كمية أقل من المذيب . 2. الثاني : أعمدة الحماية Guard Columns هذا النوع من الأعمدة يكون موقعه في العادة في جهاز HPLC قبل العمود التحليلي والفائدة الأساسية له حماية العمود التحليلي وزيادة عمره ، ويقوم عمود الحماية بتشبيع الطور المتحرك بالطور الثابت والذي يتكون من نفس مادة الطور الثابت في عمود التحليل ولكن حجم الحبيبات أكبر ، فبقى الطور الثابت في عمود التحليل.

المكون السادس : مثبت درجة الحرارة الذاتية للأعمدة Column Thermostats

بصفة عامة تتم معظم أجهزة HPLC يجري التحليل فيها عند درجة حرارة الغرفة ، لذا فإن مراقبة الحرارة ليست مهمة . لكن في بعض الحالات أو التطبيقات تتطلب درجة حرارة معينة ، فلابد التأكد من أن درجة الحرارة ثابتة من أول التجربة حتى نهايتها فلو حدث تغير في درجة الحرارة فإن هذه الأجهزة تعمل على تثبيت على درجة الحرارة .

المكون السابع : المقدرات Detectors

مميزات المقدر المثالي 1. أن يكون ذو حساسية ملائمة للقياس المطلوب . 2. أن يكون ذو ثباتية جيدة Reproducibility وتكرارية عالية . 3. ان يكون له مدى خطي طويل للمواد المقدرة . 4. أن يكون له زمن استجابة قصيرة ، ومستقلة عن سرعة السريان. 5. أن يمكن الاعتماد على النتائج المتحصل عليه ، وأن يكون سهل الاستخدام من قبل أشخاص غير مؤهلين بخبرة كافية . 6. أن يكون ذو استجابة عامة لمعظم العينات المقاسة ، أو أن يكون له استجابة انتقائية لمجموعة معينة من المواد . 7. أن يكون غير متلف للعينة non – destructive . 8. أن يكون له أقل حجم داخلي ، وذلك لتقليل من تعريض نطاق العينة.